一、重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)
1.挑取轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒的單菌落,接種于 3ml 選擇性 LB 液體培養(yǎng)基中,37 oC,250rpm/min 振搖培養(yǎng)過(guò)夜。
2. 次日將培養(yǎng)過(guò)夜的菌液 500 μl 再接種于 10 ml(1:::20)選擇性 LB 液體培養(yǎng)基中,37 oC,250 rpm/min 振搖培養(yǎng)至光密度(OD600=0.6)時(shí),取 1 ml 樣本作為誘導(dǎo)前標(biāo)本,10000g 離心 1 min 收集菌體沉淀,-20 oC 凍存?zhèn)溆谩?br>
3. 加入 1 mol/L IPTG 于菌液中,使 IPTG 終濃度為 1 mM,37 oC,250 rpm/min振搖培養(yǎng) 4~5 小時(shí)。取 1 ml 樣本作為誘導(dǎo)后標(biāo)本,同上法收集菌體沉淀,-20 oC 凍存?zhèn)溆谩?br>
4. 將誘導(dǎo)前后菌體沉淀用 20 ~ 40 μl PBS(pH= 8.0)重懸,加入等體積的 2×SDS上樣緩沖液,煮沸加熱 5 min,SDS 聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離 ,考馬斯亮藍(lán)染色 3 小時(shí)后,脫色觀察結(jié)果。
5. 選取誘導(dǎo)成功的細(xì)菌克隆,擴(kuò)大誘導(dǎo)規(guī)模,收集菌體沉淀,于-20 oC 保 存 ,準(zhǔn)備做下一步分析及純化。
二、重組蛋白質(zhì)的分離純化
重組蛋白質(zhì)的可溶性鑒定
1.將按上法誘導(dǎo)培養(yǎng)后收集的菌體重懸于裂解液 1 (Lysis buffer under nativeconditions )中,然后在-80 oC 低溫冰箱中放置 10 min。
2. 冰中解凍。
3. 在冰浴上用超聲破碎儀破菌 6 次,每次 10 sec,間歇 10 sec,電壓 200-300 V。
4. 10000g,4oC,離心 20 min,取上清(為溶液 A), -20 oC 保存;另將沉淀用同樣裂解液 1 溶解(為溶液 B),同樣-20 oC 保存,供后繼分析使用。
5. 將上述 A、B 溶液和誘導(dǎo)前后的細(xì)菌進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳,考馬斯亮藍(lán)染色,比較分析重組蛋白質(zhì)的溶解性。如果誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)位于 A 溶液中,則為可溶性蛋白;如果是在 B 溶液中,則為非可溶蛋白。
重組蛋白質(zhì)為非可溶性蛋白(變性條件下)的分離純化
1.將菌體沉淀溶于適量裂解液 2(Lysis buffer under denaturing conditions )中,室溫下攪拌和吹打沉淀,避免泡沫生成。
2. 10000g,4 oC,離心 30 min,收集上清液。
3. 將 Ni-NTA Agarose 充填柱子,并連接于 Pharmarcia 低壓液相層析系統(tǒng),用 5倍柱體積的裂解液 2 平衡 Ni-NTA Agarose,調(diào)節(jié) A280 值至零線。
4.將適量上清液上樣到 Ni-NTA Agarose 柱子中,并用 lysis buffer 沖洗至 A280值低于 0.01。
5. 分別用 5~10 倍柱體積的清洗液 1 和清洗液 2(Wash buffer 1 and 2)清洗柱子,直至 A280 值低于 0.01。
6. 用洗脫液(Elution buffer)洗脫重組蛋白質(zhì),在 A280 值監(jiān)測(cè)下,收集出現(xiàn)峰線后含有重組蛋白的所有洗脫液。
三、重組蛋白質(zhì)的復(fù)性、凍干和定量
純化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液緩慢透析,最終用 0.01×PBS 透析,透析后的蛋白質(zhì)溶液經(jīng)凍干成粉狀。以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn),采用 BIO-RAD 公司蛋白質(zhì)定量試劑(protein assay)比色測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。