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發(fā)布日期:2024/6/28 9:09:00

1.目的
學(xué)會(huì)CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

2.原理
細(xì)菌在0℃ CaCl2低滲溶液中脹成球形,丟失部分膜蛋白,成為容易吸收外源DNA的狀態(tài)。

3.器材
旋渦混合器,微量移液取樣器,移液器吸頭,50ml 微量離心管,1.5ml 微量離心管,雙面微量離心管架,臺(tái)式冷凍離心機(jī),制冰機(jī),恒溫?fù)u床,分光光度計(jì),超凈工作臺(tái),恒溫培養(yǎng)箱,搖菌試管,三角燒瓶,接種環(huán)。

4.試劑
E. coli XL1-Blue,LB培養(yǎng)基,0.1 mol/L CaCl2溶液,無(wú)菌ddH2O

5.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1.5ml離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒(滅菌);平板培養(yǎng)基,LB培養(yǎng)基(滅菌),冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液(滅菌),無(wú)菌ddH2O,搖菌試管(滅菌),三角燒瓶(滅菌)。

6.操作步驟
(1)取一支無(wú)菌的搖菌試管,在超凈工作臺(tái)中加入2ml LB(不含抗菌素?。┡囵B(yǎng)基。
(2)從超低溫冰柜中取出XL1-Blue菌種,放置在冰上。在超凈工作臺(tái)中用燒紅的接種環(huán)插入凍結(jié)的菌中,然后接入含2ml LB培養(yǎng)基的試管中,37℃搖床培養(yǎng)過夜。
(3)取0.5ml上述菌液轉(zhuǎn)接到含有50ml LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中,37℃下250r/min搖床培養(yǎng)2~3h,測(cè)定OD600為0.375(<0.4~0.6,細(xì)胞數(shù)<108/ml,此為關(guān)鍵參數(shù)?。R韵虏僮鞒x心外,都在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。
(4)將菌液分裝到1.5ml預(yù)冷無(wú)菌的聚丙烯離心管中,于冰上放置10min,然后于4℃,5000rpm離心 10min。
(5)將離心管倒置以倒盡上清液,加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液,立即在渦旋混合器上混勻,插入冰中放置30min。
(6)4℃,5000rpm離心10min,棄上清液后,用1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂懸,插入冰中放置30min。
(7)4℃,5000rpm離心10min,棄上清液后,用200μl 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂懸,超凈工作臺(tái)中按每管100ml分裝到1.5ml離心管中??梢灾苯佑米鬓D(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),或立即放入-80℃超低溫冰柜中保藏(可存放數(shù)月)。
(8)在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇,擦干桌面。
 

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