一、實驗?zāi)康?/strong>
(1)掌握蛋白質(zhì)鹽析沉淀的基本原理與操作。
(2)掌握蛋白質(zhì)透析分離的基本操作。
二、實驗原理
蛋白質(zhì)是親水膠體，借助水化膜和同性電荷(在pH7.0的溶液中一般蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷)相互排斥作用維持蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定，向蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽可破壞這些穩(wěn)定因素，使蛋白質(zhì)沉淀析出，稱為鹽析。鹽析所得到的蛋白質(zhì)沉淀經(jīng)透析或用水稀釋以減低或除去鹽后，蛋白質(zhì)能再次溶解并恢復(fù)其天然結(jié)構(gòu)和生物活性，稱為透析。由于蛋白質(zhì)分子量很大，其顆粒直徑范圍在1～100nm內(nèi)，不能透過半透膜。選用合適孔徑的半透膜可使小分子物質(zhì)透過，而蛋白質(zhì)不能透過半透膜，從而可以除去與蛋白質(zhì)混合的中性鹽及其他小分子物質(zhì)。蛋白質(zhì)鹽析常用中性鹽，如硫酸銨、硫酸鈉、NaCl等。蛋白質(zhì)經(jīng)鹽析沉淀后，需脫鹽才能獲得純品。脫鹽最常用的方法為透析法。由于蛋白質(zhì)分子量較大，不能透過半透膜，而無機(jī)鹽及其他低分子物質(zhì)可以透過，故利用透析法可將鹽析得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。將蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋內(nèi)，袋口用線扎緊，然后將其放進(jìn)蒸餾水中，蛋白質(zhì)分子量大，不能透過透析袋而被截留在袋內(nèi)，而小分子鹽由于透析袋內(nèi)外濃度差，可透過透析袋，通過不斷更換袋外蒸餾水，直至袋內(nèi)鹽分透析完為止。透析常需較長時間，為保證蛋白質(zhì)不變性，透析宜在低溫下進(jìn)行。
三、實驗材料與試劑
1.實驗材料
10%雞蛋清溶液，含雞蛋清的氯化鈉蛋白質(zhì)溶液。
2.主要實驗試劑
飽和硫酸銨溶液：稱取固體硫酸銨850g加入1000mL蒸餾水中，在70～80℃下攪拌溶解，室溫放置過夜，杯底析出白色晶體，上清液即為飽和硫酸銨溶液。
硫酸銨晶體、1%硝酸銀溶液等。
四、實驗步驟
1.透析袋的預(yù)處理
為防干裂，新透析袋出廠時常用10%甘油進(jìn)行處理，并含少量的硫化物、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質(zhì)，需除去。將透析袋剪成100～120mm的小段，用50%乙醇煮沸1h，再依次用50%乙醇、0.01mol/L碳酸氫鈉和0.001mol/LEDTA溶液洗滌，最后用蒸餾水沖洗3～5次(新透析袋如不作上述特殊處理，也可用沸水煮5～10min，再用蒸餾水洗凈即可使用)。透析袋一端用橡皮筋或線繩扎緊，也可用特殊的透析袋夾夾緊，從另一端灌滿水，用手指稍加壓，檢查是否有滲漏，沒有滲漏后方可使用。處理好的透析袋保存于蒸餾水中待用。
2.蛋白質(zhì)鹽析
取10%雞蛋清溶液5mL于試管中，加入等量飽和硫酸銨溶液，微微搖動試管，使溶液混合后靜置數(shù)分鐘，蛋清蛋白質(zhì)即可析出。如無沉淀可再加少許飽和硫酸銨溶液，觀察蛋白質(zhì)的析出。取少量沉淀的蛋白質(zhì)，加水稀釋，觀察沉淀是否會再次溶解。
3.蛋白質(zhì)的透析
注入含雞蛋清的氯化鈉蛋白質(zhì)溶液5mL于透析袋中，將袋的開口端用線扎緊，并懸掛在盛有蒸餾水的燒杯中，開口端位于液面之上。10min后，自燒杯中取出1mL溶液于試管中，加1%硝酸銀溶液一滴，如有白色氯化銀沉淀生成，則證明蒸餾水中有Cl-存在。再自燒杯中取出1mL溶液置于另一試管中，加入1mL10%氫氧化鈉溶液，然后滴加1～2滴1%硫酸銅溶液，觀察有無藍(lán)紫色出現(xiàn)。每隔20min更換蒸餾水一次，數(shù)小時后可觀察到透析袋內(nèi)出現(xiàn)輕微混濁，此為蛋白質(zhì)沉淀。繼續(xù)透析至蒸餾水中不再生成氯化銀沉淀為止。實驗記錄透析完成所需的時間。
五、注意事項
蛋白質(zhì)溶液用透析除鹽時，正負(fù)離子透過半透膜的速度不相同，如(NH4)2SO4中的?透析速度快，而透析過程中膜內(nèi)的?會生成H2SO4，使膜內(nèi)蛋白質(zhì)溶液呈酸性。因此，為避免蛋白質(zhì)變性，用鹽析法純化蛋白質(zhì)時，開始時應(yīng)用0.1mol/L的NH4OH透析。此外，為了保證蛋白質(zhì)在透析過程中不發(fā)生變性，可以將透析過程置于低溫下進(jìn)行。
