實驗原理
細菌的芽胞具有厚而致密的壁,透性低,不易著色,若用一般染色法只能使菌體著色而芽胞不著色(芽孢呈無色透明狀)。芽孢染色法就是根據(jù)芽孢既難以染色而一旦染上色后又難以脫色這一特點而設計的。所有的芽孢染色法都基于同一個原則:除了用著色力強的染料外,還需要加熱,以促進芽孢著色。當染芽孢時,菌體也會著色,然后水洗,芽孢染上的顏色難以滲出,而菌體會脫色。然后用對比度強的染料對菌體復染,使菌體和芽孢呈現(xiàn)出不同的顏色,因而能更明顯地襯托出芽孢,便于觀察。
實驗器材
1.活材料
培養(yǎng)36小時的蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)或者枯草桿菌(Bacillus subtilis)。
2.染色液和試劑
5%孔雀綠水溶液、0.5%蕃紅水溶液。
3.器材
小試管(75mm×10mm)、燒杯(300mL)、滴管、玻片擱架、接種環(huán)、擦鏡紙、鑷子、顯微鏡等。
實驗方法
1.改良的Schaeffer和Fulton氏染色法
(1)制備菌液:加1—2滴無菌水于小試管中,用接種環(huán)從斜面上挑取2—3環(huán)的菌體于試管中并充分打勻,制成濃稠的菌液。
(2)加染色液:加5%孔雀綠水溶液2—3滴于小試管中,用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。
(3)加熱:將此試管浸于沸水?。?,加熱15—20min。
(4)涂片:用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌液于潔凈的載玻片上,做成涂面,晾干。
(5)固定:將涂片通過酒精燈火焰3次。
(6)脫色:用水洗直至流出的水中無孔雀綠顏色為止。
(7)復染:加蕃紅水溶液染色5min后,傾去染色液,不用水洗,直接用吸水紙吸干。
(8)鏡檢:先低倍,再高倍,最后用油鏡觀察。
結果:芽孢呈綠色,芽孢囊和菌體為紅色。
2.Schaeffer與Fulton氏染色法
(1)涂片:按常規(guī)方法將待檢細菌制成涂片。
(2)晾干固定:待涂片晾干后在酒精燈火焰上通過2—3次。
(3)染色:
①加染色液:加5%孔雀綠水溶液于涂片處(染料以鋪滿涂片為度),然后將涂片放在銅板上,用酒精燈火焰加熱至染液冒蒸汽時開始計算時間,約維持 15-20min。加熱過程中要隨時添加染色液,切勿讓標本干涸。(加熱時溫度不能太高)。
②水洗:待玻片冷卻后 ,用水輕輕地沖洗,直至流出的水中無染色液為止。
③復染:用蕃紅液染色5min。
(4)水洗、晾干或吸干。
(5)鏡檢:先低倍,再高倍,最后在油鏡下觀察芽孢和菌體的形態(tài)。
結果:芽孢呈綠色,菌體為紅色。
注意事項
1.供芽孢染色用的菌種應控制菌齡。
2.改良法在節(jié)約染料、簡化操作及提高標本質量等方面都較常規(guī)涂片法優(yōu)越,可優(yōu)先使用。
3.用改良法時,欲得到好的涂片,首先要制備濃稠的菌液,其次是從小試管中取染色的菌液時,應先用接種環(huán)充分攪拌,然后再挑取菌液,否則菌體沉于管底,涂片時菌體太少。