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發(fā)布日期:2024/5/14 9:09:00

  凍存原理
  
  當(dāng)細(xì)胞所處溫度低于0°C時(shí),細(xì)胞脫水,細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高,并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶,冰晶的大小對(duì)細(xì)胞的影響是不同的,大冰晶容易造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂,故造成復(fù)蘇出來的細(xì)胞存活率、狀態(tài)等與凍存前的狀態(tài)相差甚遠(yuǎn)。因此,我們在凍存細(xì)胞的時(shí)候會(huì)采取兩個(gè)措施,一加入低溫保護(hù)劑,二,慢凍細(xì)胞
  
  凍存時(shí)機(jī):細(xì)胞應(yīng)在生長良好、密度約為 80-90%、數(shù)目一般為 10 6 -10 7 /ml,活力差的細(xì)胞在凍存后的成活率很小。
  
  低溫保護(hù)劑:常用的低溫保護(hù)劑是二甲基亞砜DMSO,它是一種滲透保護(hù)劑,可迅速透入細(xì)胞,提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性,降低冰點(diǎn),延緩凍結(jié)過程,能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外,在胞外形成冰晶,減少胞內(nèi)冰晶,從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。
  
  慢凍細(xì)胞:可以使用程序性降溫盒,緩慢凍存細(xì)胞,可使細(xì)胞內(nèi)避免產(chǎn)生大的冰晶。如果沒有程序降溫盒,可以將凍存細(xì)胞依次放于4度1h,-20度2h,-80過夜,大部分細(xì)胞也可以適應(yīng)。
  
  凍存液配置:凍存液應(yīng)該提前配制,置于室溫備用,防止臨時(shí)配制產(chǎn)生的熱量損傷細(xì)胞(DMSO加入到培養(yǎng)基中會(huì)放熱),凍存液常規(guī)配比為培養(yǎng)基:血清:DMSO=7:2:1,如果細(xì)胞比較珍貴,可以調(diào)整為血清:DMSO=9:1。
  
  操作步驟:
  
  1.用移液器吸走原培養(yǎng)基,加入適量PBS洗1-2遍;
  
  2.消化細(xì)胞:加入適量胰酶,置于培養(yǎng)箱中37°C消化(10厘米大皿中加入1ml 0.25%的胰酶,消化4-5min,注意不同細(xì)胞消化時(shí)間不同,終止消化截點(diǎn)為鏡下觀察80%-90%以上的細(xì)胞變圓);
  
  3.待消化到位后加入胰酶2倍體積的完全培養(yǎng)基終止消化,800-1000rpm離心3-5min;
  
  4.準(zhǔn)備好凍存管,標(biāo)記上日期,細(xì)胞類別,人名,代數(shù),待細(xì)胞離心后去上清,加入凍存液重懸,每管1-1.5ml,轉(zhuǎn)移到凍存管中;
  
  5.將凍存管放入程序降溫盒中,-80度過夜,然后轉(zhuǎn)移到液氮中保存。
  
  注意事項(xiàng)
  
  1、  細(xì)胞加入凍存液之后立即放入-80度保存,勿常溫放置太久
  
  2、 凍存細(xì)胞儲(chǔ)存在-80度中通常不建議超過半年,液氮中通常不建議超過2年。

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