免疫熒光的原理
免疫熒光(Immunofluorescence,IF)原理免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán),再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位,以及利用定量技術(shù)(比如流式細(xì)胞儀)測(cè)定含量。
紫外光激發(fā)熒光物質(zhì)放射熒光示意圖免疫熒光實(shí)驗(yàn)的主要步驟包括細(xì)胞片制備、固定及通透(或稱為透化)、封閉、抗體孵育及熒光檢測(cè)等。細(xì)胞片制備(通俗的說法是細(xì)胞爬片)是免疫熒光實(shí)驗(yàn)的第一步,細(xì)胞片的質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)的成敗至關(guān)重要,原因很簡(jiǎn)單,如果發(fā)生細(xì)胞掉片,一切都無從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片(SlidesorCoverslips)的處理以及細(xì)胞的活力,有人根據(jù)成功經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出許多有益的細(xì)節(jié)或小竅門,非常值得借鑒。
固定和通透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒ǎ线m的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法(如ELISA或WesternBlot)中的相同步驟是類似的,最重要的區(qū)別在于免疫熒光實(shí)驗(yàn)中要用到熒光抗體,因此必須謹(jǐn)記避光操作,此外抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。最后需要注意的是,標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察,或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存,以免因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響。
用于免疫熒光染色的染料需具備以下幾個(gè)條件:
熒光染料應(yīng)有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù);
熒光染料對(duì)488nm的激發(fā)光波長(zhǎng)有較強(qiáng)的吸收;
發(fā)射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)之間應(yīng)有較大的波長(zhǎng)差;
容易與被標(biāo)記的單克隆抗體結(jié)合而不影響抗體自身的特異性。
1.異硫氰酸熒光素(FITC):可產(chǎn)生亮綠色熒光。FITC是免疫熒光標(biāo)記最常用的熒光探針。
2.德州紅:與生物素偶聯(lián)的抗體有很強(qiáng)的親和力,產(chǎn)生紅色熒光。
3.藻膽蛋白類:主要包括藻紅蛋白(PE)、藻青蛋白(PC)、別藻青蛋白(APC)三類。多發(fā)生橙色至紅色熒光。
4.能量傳遞復(fù)合染料