WB免疫印跡法，也稱免疫轉(zhuǎn)移技術(shù)IBT(Immunoblotting)，是Towbin將1975年Southern發(fā)明的Soutnern blotting技術(shù)應(yīng)用于蛋白-蛋白相互作用建立的免疫學(xué)檢測方法。其操作簡便，主要用于未知蛋白檢測及抗原組分、抗原決定簇鑒定，同時也用于未知抗體的檢測和單抗鑒定等，在生物學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床疾病早期診斷和預(yù)后跟蹤分析方面都有應(yīng)用。
WB實驗中使用到的有三種抗體：一抗、二抗和內(nèi)參抗體。一抗是唯一針對目標抗原的抗體，可以進行制備也可以購買現(xiàn)貨，難度系數(shù)較高；二抗直接買就OK，只是需要留意下種屬選擇；內(nèi)參抗體必不可少，是WB實驗中的質(zhì)控環(huán)節(jié)。那么，在制備抗體或者選擇抗體時，是不是十分糾結(jié)？今天，遠慕跟大家聊一聊。
WB檢測之一抗
一抗制備
如果目的蛋白的現(xiàn)貨抗體沒有找到，或者都不中意，就需要親自動手制備了，請公司幫你做也不錯哦！自己制備一抗通常情況下可以選小鼠、兔制備多抗或者選小鼠制備單抗，前者省時省錢，后者耗時耗財卻各有優(yōu)缺點。多抗制備出來容易產(chǎn)生雜帶，卻容易出結(jié)果，單抗制備出來能得到單一條帶及一張漂亮的WB圖片，拿去炫耀下也不錯。然而做單抗如果沒有強有力的細胞培養(yǎng)、融合、篩選經(jīng)驗，也有各種意想不到的結(jié)果。比如完敗，或者只篩到一株卻不能做WB。不過在每一步實驗中注意細節(jié)還是可以得到滿意的抗體的。
多抗制備過程：
第一步：免疫及效價檢測。看似只是把抗原打進動物體內(nèi)，其實暗藏玄機，不同的免疫方式效果不一。通常情況下，免疫效果排序如下：皮內(nèi)>皮下>腹腔>靜脈，通常采用皮內(nèi)或皮下免疫。免疫劑量過多過少均會產(chǎn)生免疫耐受，一般小鼠每次每只免疫50 μg共4次，兔每次每只免疫300-500 μg共5次。每次免疫后測定效價均要設(shè)置對照，以排除各種情況導(dǎo)致的ELISA假陽性或假陰性。
第二步：取血。小鼠取血通常采用眼球取血，一只小鼠可得到大約1.5 mL的抗血清。兔取血通常采用頸動脈取血，一只兔可得到大約25 mL的抗血清。
第三步：抗體純化。單抗的純化使用proteinA/G即可，得到的都是均一性的抗體分子。多抗的純化可以采用proteinA/G或抗原親和純化，后者篩掉了一些非特異性的IgG，留下的都是能與抗原結(jié)合的抗體，所以能在一定程度上避免WB結(jié)果的雜帶問題。
單抗制備過程：
第一步：參照多抗制備的第一步。
第二步：細胞融合。細胞在融合的過程中非常脆弱，所以勁道要輕、時間要把控好，一般按照標準的融合方案來，做到能一手畫圓一手畫圈，此步需要向郭靖童鞋學(xué)習(xí)，手不要抖則基本達標，可以在融合板里看到很多圓溜溜的單克隆。
第三步：亞克隆?；旧铣绦蚧僮鳎瑢毎荡虿灰菥托?。
第四步：篩選檢測。細胞融合及亞克隆后都要對細胞上清進行篩選檢測。細胞單克隆在生長過程中容易因為外力散落成不規(guī)則形狀而影響判斷，或許一個很好的陽性克隆就這么被忽略掉了。所以千萬不要讓你的板子磕到了，尤其是融合的細胞板換液時更是要極其小心。當(dāng)然，如果不嫌麻煩可以把融合板的單克隆挑到新的細胞板再進行檢測。
第五步：腹水制備。將篩選的陽性單抗細胞株注射到小鼠腹腔，經(jīng)過一段時間小鼠腹腔會產(chǎn)生含高濃度單抗的腹水。注射的細胞數(shù)量不宜過多或過少，過少會導(dǎo)致不生成腹水或周期過長，過多會導(dǎo)致小鼠過早死亡。一般一只小鼠腹腔注射10^6個細胞即可，大約2周即可取腹水。
第六步：參照多抗制備的第三步。
一抗選擇
如果有現(xiàn)貨，就不用花時間精力再去自己制備啦，快來get現(xiàn)貨一抗選擇新技能！
①抗體的說明書中明確指明可用于WB檢測的是首選。但沒寫不表示不能做，可能廠商沒有驗證，如果確實需要這個或者只有這一個，可以向廠商申請試用裝哦。
②抗體適用的種屬也是需要考慮的。說明書中也會寫明，如果研究樣本的來源物種不在列表里，也并不代表就不能使用，不過最好不用。當(dāng)然抗體的適用性與不同物種統(tǒng)一蛋白的序列相似性有關(guān)，用信息學(xué)的方法比對一下可以預(yù)測抗體是否可用，如果同源性較高的話還是可以選擇的。
③抗原類型也需要審視。免疫原不限于蛋白，菌體或細胞都可以作為免疫原，在選擇時要進行區(qū)分。比如要檢測的是蛋白的區(qū)段或同型物，就要選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。
④如果一抗是未標記的，后續(xù)還需使用二抗，則選擇的一抗來源物種與樣本來源物種要避免相同導(dǎo)致交叉反應(yīng)。比如檢測大鼠組織內(nèi)目的蛋白，則最好選兔抗鼠的一抗，而不選擇小鼠來源的一抗。如果一抗是標記的，則可以不考慮這個問題。
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