實驗流程簡介
一、SP三步法
1）石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。
2)0.3%或3%H2O2去離子水（無色液體）孵育10-30分鐘，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。
3）蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘
4）候選步驟：采用抗原修復(fù)：微波（建議30分鐘內(nèi)4次中火）、高壓、酶修復(fù)方法。自然冷卻，再用3分鐘×3次.
5）血清封閉：室溫15-30分鐘，盡可能與二抗來源一致。傾去，勿洗。
6）滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37℃孵育2~3小時或4℃過夜（最好復(fù)溫）。PBS沖洗，3分鐘×5次。
7）滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫或37℃孵育30分鐘-1h。
8)PBS沖洗，3分鐘×5次。
9）滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30分鐘-1h。10)PBS沖洗，3分鐘×5次。
11）顯色劑顯色（DAB等）。
12）自來水充分沖洗。
13）可進(jìn)行復(fù)染，脫水，透明。
14）選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒┓馄?br>
二、即用型二步法
1）脫蠟、水化組織切片。
2）根據(jù)所應(yīng)用的一抗的特殊要求，對組織切片進(jìn)行預(yù)處理。
3)0.3%或3%H2O2去離子水孵育5分鐘-30分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS或TBS沖洗。
4）滴加一抗，室溫或37℃孵育30~60分鐘，或4℃過夜，PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。
5）滴加enhangcer增強劑，37℃30min，PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。
6）滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體，室溫/37℃孵育30分鐘-1h，PBS/TBS沖洗，3分鐘×5次。
7）應(yīng)用DAB溶液顯色。
8）蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。
三、免疫熒光技術(shù)（略）
1、酶免疫組化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)
1）標(biāo)本固定
固定的目的是①防止標(biāo)本從玻片上脫落；
②除去妨礙抗原-抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果；
③固定的標(biāo)本易于保存。固定劑的選擇一般用4%多聚甲醛，但睪丸組織、眼可能要選用Bouin’s液或mDF液效果較好。
2）脫水、石蠟包埋和制片
脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對組織要完全浸蠟、切片時刀片要干凈和鋒利。否則，容易裂片和脫片等。
3）脫蠟和水化
這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合反應(yīng)。脫蠟可以先60℃20min，然后立即二甲苯1-3分別10min（這個時間是由二甲苯新鮮程度和室溫等綜合決定的），但當(dāng)天制好的切片一般先60℃3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。
4）抗原修復(fù)
由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。常用的修復(fù)方法從強到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高pH的等）。我們實驗室一般用微波修復(fù)中火6min*4次，效果不錯。注意微波修復(fù)后自然冷卻30min左右（只要你覺得修復(fù)液的溫度達(dá)室溫即可）。
5）細(xì)胞通透
目的是使抗體能夠充分地進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。在免疫組織化學(xué)（>10um厚切片）和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用Triton X-100 作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。同時也是一種去污劑，一般在PBS中加入后終濃度是0.05%即可，而前者終濃度是0.5%-1%。石蠟切片4um左右可以不通透，因為細(xì)胞已經(jīng)被切開了。
6）滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生物素
在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易收到內(nèi)源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活。滅活內(nèi)源性POD一般3%過氧化氫滅活時間短點，可以10min左右，而0.3%過氧化氫則可以適當(dāng)延長封閉時間，一般10~30min；用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護抗原和固定組織作用，過氧化氫孵育時間過長易引起脫片；現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4℃避光保存。不過，現(xiàn)在已有“第二代即用型免疫組化試劑盒”避免內(nèi)源性生物素的干擾，推薦使用。
7）血清封閉
組織切片上有剩余的位點可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性；封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點發(fā)生結(jié)合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。一般室溫10-30min。但也要防止封閉過度
8）一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r間
一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37℃1-2h，而4℃過夜和從冰箱拿出后37℃復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。
二抗孵育條件：二抗一般室溫或37℃30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。建議一抗反應(yīng)在4℃最佳，反應(yīng)溫和，但時間最好超過16~24h。
9）抗體稀釋液
其實許多實驗室抗體稀釋液就用一般PBS即可，但專用的抗體稀釋液中除PBS成份外，還加了疊氮化鈉防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份，對抗體的多次回收利用較好。正因為這種原因，我一直用國產(chǎn)的專用抗體稀釋液，一段時間在更換新抗體稀釋液時實驗結(jié)果出現(xiàn)了陰性結(jié)果（提示可能一抗沒有結(jié)合），最后從抗體濃度和孵育時間、封閉時間等原因排除后，發(fā)現(xiàn)是新抗體稀釋液的PH值偏酸，而使抗原抗體反應(yīng)不佳，終而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
10）切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）
為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌娗逑矗ㄑ娱L時間和增多次數(shù)）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。
注意：①單獨沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。
②溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；
③沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。
④PBS的PH和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時我買的抗體稀釋液偏酸，結(jié)果背景一片黃（未見特異性染色），建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。（中性及弱堿性條件（PH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強度則有利于分解）
11)DAB顯色
背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現(xiàn)特異性染色較強而本底著色較淺時即可沖洗；DAB顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；此外，若很短時間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；DAB顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短（最好一抗4℃過夜）；另一方面就是封閉時間過長。
12）復(fù)染
目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，經(jīng)常用蘇木素復(fù)染（胞核染料）。注意蘇木素復(fù)染時間要看當(dāng)時的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘，胞漿蛋白可以適當(dāng)時間長一點，而胞核蛋白則要短。不過這個如果染色不理想可以補救的。方法是：染色深則分化時間稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒（一定動作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。
13）封片
為了長期保存，我們一般用中性樹膠等封片，避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產(chǎn)生氣泡。
2、免疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié)
1）冰凍切片制備
建議用新鮮組織，否則組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴(yán)重。
2）組織切片固定
切好片風(fēng)干后立即用冰丙酮等固定液進(jìn)行固定5-10min，尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當(dāng)保存。
3）血清封閉
為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調(diào)整的，一般10-30min。
4）一抗孵育條件
在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37℃1-2h，而4℃過夜和從冰箱拿出后37℃復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。
5）二抗孵育條件
二抗一般室溫或37℃30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應(yīng)。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。最后，熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時間的延長，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時小包裝和并進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x心。
6）復(fù)染
目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位。一般常用DAPI復(fù)染。
7）封片
為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產(chǎn)生氣泡。
8）切片清洗
為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌娗逑矗ㄑ娱L時間和增多次數(shù)）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。
注意：
⑴單獨沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。
⑵溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；
⑶沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。
⑷PBS的PH和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時我買的抗體稀釋液偏酸，結(jié)果背景一片黃（未見特異性染色），建議pH在7.4-7.6濃度是0.01M。（中性及弱堿性條件（pH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強度則有利于分解）
9）拍照
有條件的話最好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序；應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護眼鏡；檢查時間每次以1~2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射3~5min后，熒光也明顯減弱或褪色；激發(fā)光長時間的照射，會發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象；所以最多不得超過2~3h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。天熱時，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再啟用時，須待燈光充分冷卻后才能點燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源。關(guān)閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后；標(biāo)本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發(fā)；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發(fā)熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。
