PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),對(duì)于常年狂奔在實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)人來(lái)說(shuō)并不陌生。那么,對(duì)于PCR反應(yīng)的核心成份,DNA聚合酶,你選對(duì)了嗎?
常見(jiàn)的 DNA 聚合酶如 Taq、Phanta、Pfu、KOD、Primerstar、Klenow、Bst、Phi29 等等。根據(jù)耐熱性來(lái)分可分為耐熱酶和常溫酶。耐熱聚合酶如 Taq、Pfu、KOD、Primerstar 等,常溫聚合酶包括 Klenow、Bst、Phi29 等。根據(jù)保真度來(lái)分,高保真聚合酶 Pfu、KOD、Phanta 等,普通聚合酶 Taq 等。
DNA聚合酶的功能
1)通過(guò)核苷酸聚合反應(yīng),使DNA鏈沿5’→3’方向延長(zhǎng)(DNA聚合酶活性)[1]
2)催化由3’端水解DNA鏈(3’→ 5’核酸外切酶活性,用于切除錯(cuò)配的堿基)[1]
3)催化由5’端水解DNA鏈(5’→ 3’核酸外切酶活性,用于切除引物)[1]
4)催化由3’端使DNA鏈發(fā)生焦磷酸解
5)催化無(wú)機(jī)焦磷酸鹽與脫氧核糖核苷酸三磷酸之間的焦磷酸基的交換
面對(duì)如此之多的選擇,大多數(shù)剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的新生們默默表示,選擇恐懼癥犯了……那么,解決的方法是,根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的 DNA 聚合酶。比如:常規(guī)的 PCR 擴(kuò)增和菌液鑒定,長(zhǎng)度小于 5kb 的片段,保真度要求不高,使用 Taq 酶擴(kuò)增即可。選用 Mix 的形式,混樣更加簡(jiǎn)單,操作更加便捷。如果混樣泡沫多,想滅掉泡沫的話,推薦大家使用 Green Taq Mix。想要獲得較高的產(chǎn)量,可以選擇 Taq Plus DNA 聚合酶,相對(duì)于 Taq 酶擴(kuò)增性能更強(qiáng)。
1. 選擇熱啟動(dòng)酶降低非特異性擴(kuò)增
在使用 Taq 酶進(jìn)行擴(kuò)增時(shí),有時(shí)會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,可能的原因可以從模板、引物、體系、程序中一一排查。如模板是否被污染,引物特異性如何,Mg2+濃度偏高等等,其中一個(gè)不可忽視的原因是 DNA 聚合酶的種類是否合適。如果排查了其它原因仍舊有非特異性產(chǎn)物,可以選擇熱啟動(dòng)酶重新實(shí)驗(yàn),即可有效減少或消除體系中其它產(chǎn)物的積累。常用的熱啟動(dòng)酶分為兩類:一類是化學(xué)法修飾的熱啟動(dòng)酶,如 Ace Taq ,預(yù)變性 95℃5 - 10 min 即可釋放酶活;一類是抗體法修飾的熱啟動(dòng)酶,如 Champagne Taq ,預(yù)變性 95℃30s 即可釋放酶活。使用時(shí)注意預(yù)變性時(shí)間,方能獲得滿意的擴(kuò)增效果。
2. 選擇 Lamp 擴(kuò)增長(zhǎng)片段
大于 5Kb 的長(zhǎng)片段又該如何擴(kuò)增呢?如果實(shí)驗(yàn)對(duì)保真度的需求不高,那么就可以使用 LAmp DNA 聚合酶。其保真度是 Taq 酶的 6 倍,可擴(kuò)增超過(guò) 20Kb 的基因組、cDNA 片段,對(duì)于低拷貝、低純度、以及不同 GC 含量的模板都具有很高的成功率。
3. 選擇高保真酶快速高效擴(kuò)增
如果實(shí)驗(yàn)對(duì)保真度要求較高,在選擇 DNA 聚合酶的時(shí)候就需要使用高保真酶,如 Pfu、KOD、Primerstar、Phanta 等。前三者都屬于第一代高保真酶,已在市場(chǎng)中廣泛使用。諾唯贊科研團(tuán)隊(duì)的大力改造生產(chǎn)的 Phanta 系列的高保真酶,保真度達(dá)到了 Taq 酶的 50 倍,擴(kuò)增性能、擴(kuò)增長(zhǎng)度、產(chǎn)量、模板適應(yīng)性都顯著提升。Phanta Max 保真度是 Taq 酶的 53 倍,Pfu 的 6 倍,對(duì)于質(zhì)粒等簡(jiǎn)單模板有效擴(kuò)增長(zhǎng)度可達(dá) 40kb,cDNA 有效擴(kuò)增長(zhǎng)度可達(dá) 10kb,基因組有效擴(kuò)增長(zhǎng)度可達(dá) 20kb,適合于各種 GC 含量的擴(kuò)增,可用于多種樣本的直接 PCR 如植物葉片、全血等。且擴(kuò)增僅需 30s/kb,甚至于 2kb/s。如此卓越,愛(ài)不釋手了吧?
4. 選擇直接擴(kuò)增試劑盒對(duì)粗品擴(kuò)增
xxx生產(chǎn)的各種直擴(kuò)試劑盒,直接對(duì)粗品進(jìn)行擴(kuò)增,大大減少了實(shí)驗(yàn)的工作周期。如小鼠基因型鑒定可以直接使用 One Step Mouse Genotyping Kit,全血擴(kuò)增可以直接使用 Blood Direct PCR Kit V2。