TRIzol試劑有多組分分離作用,與其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚／SDS法、鹽酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特點是可同時分離一個樣品的RNA\DNA\蛋白質(zhì)．TRIzol使樣品勻漿化，細胞裂解，溶解細胞內(nèi)含物，同時因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入lv仿離心后，溶液分為水相和有機相，RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA；用異丙醇沉淀有機相可回收蛋白質(zhì)。
TRIzol試劑可用于小量樣品（50-100mg組織、5×106細胞）也適用于大量樣品（≥1g組織、>107細胞）。對人，動物，植物組織，細菌均適用，可同時處理大量不同樣品，整個提取過程在一小時內(nèi)即可完成。分離的總RNA無蛋白質(zhì)和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA篩選，體外翻譯，RNase保護分析和分子克隆。在用于RT-PCR時如果兩條引物存在于一個單一外顯子內(nèi)，建議用無RNase的DNaseⅠ處理RNA樣品，避免出現(xiàn)假陽性。共純化的DNA可用作標(biāo)準，比較不同樣品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白質(zhì)可用于Western Blotting。
預(yù)防RNase污染注意事項：
1． 經(jīng)常更換新手套，皮膚上常帶有的細菌，霉菌可能成為RNase的來源。
2． 使用滅過菌的RNA專用塑料制品避免交*污染。
3． RNA在TRIzol試劑中時不會被RNase污染，但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，然后用水徹底清洗，高壓滅菌，即可去除RNase。
4． 配制溶液應(yīng)使用無RNase的水（將水加入處理過不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.01℅v/v,放置過夜,高壓滅菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。）
RNA的提取
準備試劑：lv仿，異丙醇，75℅乙醇，無RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配制)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養(yǎng)細胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。
9. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清。
10.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5-10分鐘即可.不要真空離心干燥，過于干燥會導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5℅SDS,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應(yīng),勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。
注意事項：
1.從少量樣品（1-10mg組織或102-104細胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進RNA沉淀。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉淀出來，糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應(yīng)。
2．勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3．分層和RNA沉淀時也可使用臺式離心機，2600×g離心30-60分鐘。
預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1×106細胞提取RNA分別為：
肝和脾6-10μg ,腎3-4μg ,骨骼肌和腦組織1-1.5μg ,胎盤1-4μg ,上皮細胞8-15μg ,成纖維細胞5-7μg 。
常見問題分析：
得率低：
A.樣品裂解或勻漿處理不徹底
B．RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65 ：A.檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高
B．樣品勻漿時加的試劑量太少
C．勻漿樣品時未在室溫放置5分鐘
D．吸取水相時混入了有機相
E．RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解：
A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍
B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.細胞在用胰酶處理時過度
D.溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理
E.電泳時使用的甲醛pH值低于了3.5
DNA污染:
A. 樣品勻漿時加的試劑量太少
B.樣品中含有有機溶劑(如乙醇,DMSO等),強緩沖液或堿性溶液
蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的過程中作以下改進可去除這些污染，步驟7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶液(0.8M檸檬酸鈉和1.2M NaCl)混合離心,按之前操作進行。這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出純RNA。從含有大量多糖的植物中提取RNA時應(yīng)在勻漿后離心，并加上以上操作步驟。
DNA的分離
準備試劑：乙醇 0.1M檸檬酸鈉(含10%乙醇) 75%乙醇 8mM NaOH
操作步驟:
1. 樣品加氯仿分層后,移去上層水相,用乙醇沉淀中間層和有機相中的DNA。每使用1ml TRIzol加0.3ml無水乙醇混勻，室溫放置3分鐘，2-8℃不超過2000×g離心5分鐘。
2. 移去上清，（如需分離蛋白質(zhì)，可保留，進一步操作見后）用含10%乙醇的0.1M檸檬酸鈉洗滌DNA沉淀。每用1ml TRIzol加入1ml檸檬酸鈉，室溫放置30分鐘，2-8℃2000×g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)一次。
3. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1ml TRIzol加入1.5-2 ml 75%乙醇,室溫放置10-20分鐘(不時顛倒混合)2-8℃2000×g離心5分鐘, 棄上清。
4. 室溫放置晾干DNA 5-15分鐘，用8mM NaOH溶解DNA。從50-70mg組織或107細胞中分離的DNA溶于300-600μl 8mM NaOH，DNA的濃度通常為0.2-0.3μg/μl 。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris緩沖液中，建議用弱堿溶解，8mMNaOH的pH值為9，溶解DNA后可用TE，HEPES調(diào)節(jié)pH。從某些樣品（尤其是組織）中提取的DNA中可能包含一些膠狀不溶物可>12000×g離心10分鐘除去。
DNA的定量：取一份溶于8mM NaOH的DNA加水測A260值。一單位A260值相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA。根據(jù)DNA產(chǎn)量可估計細胞數(shù)，人，大鼠，小鼠1×106二倍體細胞含DNA的量分別為7.1μg , 6.5μg , 5.8μg 。
預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1×106細胞提取DNA分別為肝和腎3-4μg 骨骼肌，腦組織，胎盤2-3μg 人，大鼠，小鼠培養(yǎng)細胞（1×106）5-7μg 成纖維細胞5-7μg
應(yīng)用：1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES調(diào)pH至8.4,取0.1-1μg DNA用作模板。
2.酶切反應(yīng) 用HEPES或1mM EDTA調(diào)節(jié)pH至適當(dāng)值。每μg DNA使用3-5單位的酶，80-90%的DNA是可消化的。
1ml 8mM NaOH溶解的DNA樣品pH值調(diào)節(jié)
Final pH 0.1M HEPES(μl) Final pH 1M HEPES(μl)
8.4 86 7.2 23
8.2 93 7.0 32
8.0 101
7.8 117
7.5 159
注意事項：
1. DNA在中間層和有機相中時可在2-8℃保存過夜。
2．DNA沉淀在75%乙醇中2-8℃可保存幾個月。
3．DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置過夜，如長期保存需用HEPES調(diào)節(jié)pH至7-8并且加EDTA至1mM，可置于4℃或-20℃長期保存。
