一.組織RNA提取
1.最好新鮮組織,這樣RNA提取的效果比較好,這是肯定的。
2. 如果不是新鮮的(最好在半年之內(nèi),-80℃或者液氮中凍存的)組織,注意不要反復(fù)凍融,從冰凍狀態(tài)拿到0-4℃,注意不要拿到常溫,待組織解凍后,用 DEPC泡過的剪刀剪一小塊組織,稱重后,放到預(yù)冷的勻漿器中,然后加入一定量的TRIZOL試劑,然后勻漿。
注意:速度不要太快,要勻一會挺一會,否則由于摩擦產(chǎn)熱,RNA遇熱會加速降解。如果一次做多個標(biāo)本的RNA提取,也要這樣做,更不能急。后面的步驟和細(xì)胞RNA提取一樣。
二.培養(yǎng)細(xì)胞的RNA提取
1.貼壁細(xì)胞,需要先用胰酶消化后,然后收集到離心管中,離心,去上清,然后用PBS多洗2-3次,以去除多余的胰酶。
懸浮細(xì)胞,直接用吸管或者加樣槍吹打評壁,以使細(xì)胞基本可以被吹下來。然后離心去上清,不需要用PBS洗。
2.然后將少量細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的DEPC泡過的1.5毫升EP管中,然后加入一定量的TRIZOL(細(xì)胞多的話加1毫升,細(xì)胞少的話加0.5毫升就可以),然后用槍頭吹打混勻5-10分鐘。(如果有時間就繼續(xù)往下做,如果沒有時間,可以把加了TRIZOL后的細(xì)胞裂解液凍存到-80℃,用的時候提取和新的提取的效果一樣。)在冰上操作。
3.上面的混勻5-10 分鐘,基本可以使細(xì)胞裂解,然后可以進(jìn)行下面的步驟。
注意事項:
1.一定要注意冰上操作,低溫離心。
2.戴口罩和勤換手套,去任何東西都要帶著手套去取。
3.每次去器材的時候都要用鑷子去夾,鑷子要在酒精燈上燒一下。
4.所有的器材都要經(jīng)過DEPC浸泡后高壓后才可以使用,所需要的氯仿,酒精,異丙醇等都保證沒有被RNA 酶污染,不能用沒有泡過DEPC的槍頭去提取液體,一定要用DEPC浸泡過的槍頭去吸,如果發(fā)現(xiàn)試劑有可能被污染了,要立即更換。
5. 吸取上清一定不要吸到中間層的蛋白,如果吸到蛋白一定要重新用氯仿抽提,因為,吸到的蛋白很可能會對RNA產(chǎn)生降解作用。一定要少吸,不要貪多,RNA提取不要求量,更多的要求質(zhì)。
6.最后用75%的酒精洗一次就可以,盡量減少RNA提取時間。
7.最后一步,用 DEPC水溶解RNA,不要用太多的體積,以保證RNA的濃度。
8.提取完后,電泳觀察結(jié)果,如果上面的兩條帶都比較清楚的話,說明RNA提取的不錯,可以一次多逆轉(zhuǎn)錄幾管,不要把RNA凍存,以后在逆轉(zhuǎn)錄的效果不好。