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發(fā)布日期:2023/11/3 9:53:00

冰凍切片免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟

1、冰凍切片固定

冰凍切片37℃烘烤10至20分鐘,控干水分,置于4%多聚甲醛固定30min。于PBS緩沖液中晃動(dòng)洗滌3次,每次5分鐘。

2、抗原修復(fù)

將切片浸沒(méi)在升滿(mǎn)EDTA抗原修復(fù)緩沖液(PH8.0)的修復(fù)盆中,置于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù),修復(fù)條件:中火8min至沸——?;?min保溫——中低火7min(整個(gè)過(guò)程需防止修復(fù)液過(guò)度蒸發(fā),切勿干片。

自然冷卻后,將切片置于PBS緩沖液中。然后在搖床上,晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。

3、畫(huà)圈血清封閉

切片稍甩干后,用組化筆在組織周?chē)?huà)圈,滴加組織自發(fā)熒光淬滅劑A液,室溫孵育30min,純水洗5分鐘,接著滴加BSA牛血清白蛋白,封閉30min。

4、加一抗

輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加按比例配好的一抗后,切片平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜。

5、加二抗

切片浸沒(méi)在PBS緩沖液中,然后在搖床上,晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后,滴加熒光二抗,覆蓋組織,避光室溫孵育50min。

6、DAPI復(fù)染細(xì)胞核

切片浸沒(méi)在PBS緩沖液中,晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。甩干后,在圈內(nèi)滴加即用型DAPI染液,避光室溫孵育10min。

7、淬光組織自發(fā)熒光

切片置于PBS緩沖液中,晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。在圈內(nèi)滴加組織自發(fā)熒光淬滅劑B液,避光室溫孵育5min,水洗10min。

8、封片

切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,推薦使用遠(yuǎn)慕生物配套試劑、耗材、儀器,實(shí)驗(yàn)效果更佳!

冰凍切片免疫熒光結(jié)果判讀:

DAPI染出來(lái)的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色,陽(yáng)性表達(dá)為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的紅光或綠光等。

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