1 、操作因素
1.1 涂片太厚 在涂片時(shí)細(xì)菌挑的太多，沒法分開，在脫色時(shí)就不能將第一步染上的結(jié)晶紫的顏色脫去，可能會使革蘭陰性菌也出現(xiàn)紫色，誤認(rèn)為革蘭陽性菌。
1.2 脫色時(shí)間
陽性菌透性小，不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色；但這是在固定的時(shí)間條件下的結(jié)果，如果延長脫色時(shí)間，也會使脫色劑滲透進(jìn)陽性菌的細(xì)胞壁中，使染上的結(jié)晶紫脫去顏色，最后染上復(fù)紅的顏色，變成革蘭陰性菌。而脫色時(shí)間太短的話又會使陰性菌染上的結(jié)晶紫不能完全脫色，出現(xiàn)紫色，誤認(rèn)為革蘭陽性菌。
1.3 固定方法
固定不僅能殺死細(xì)菌，改變細(xì)菌對染料的通透性，還能使細(xì)菌吸附在玻片上，保持原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)。固定方法是將干燥后的細(xì)菌涂片以中等速度通過火焰三次，以玻片觸及手背皮膚熱而不燙為宜。但在實(shí)際操作中有的同學(xué)將玻片在火焰上烤的太久，改變了細(xì)菌原有的通透性，會使細(xì)菌的染色性發(fā)生變化。影響了染色的結(jié)果。
2 、細(xì)菌因素
2.1 細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間
細(xì)菌的典型形態(tài)、染色性是在對數(shù)生長期，取這時(shí)的細(xì)菌做革蘭染色可以反應(yīng)細(xì)菌的真實(shí)的染色性。如果細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間太長，變成了老齡菌，染色性就會發(fā)生變化，可能會使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
2.2 培養(yǎng)基的成分
一般認(rèn)為革蘭陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色。但是如果培養(yǎng)基中缺乏核蛋白質(zhì)鎂鹽就不能合成菌體成分的核蛋白質(zhì)鎂鹽，細(xì)菌與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合就不牢固，容易脫色，可能會使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
3 、染液因素
3.1 碘液
碘液作為媒染劑能增加染料與被染物的親和力。如果碘液放置時(shí)間太長，或經(jīng)日光照射失效，失去媒染劑的作用，就可能使結(jié)晶紫與細(xì)菌結(jié)合的不牢固，容易被脫色，使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
3.2 結(jié)晶紫 結(jié)晶紫的濃度太高，就會使染上的顏色不容易被酒精脫色，可能會使革蘭陰性菌染成革蘭陽性菌。
3.3 酒精 酒精作為脫色劑，革蘭染色的脫色酒精濃度為95% ，在此濃度下革蘭陽性菌染上的結(jié)晶紫不易被脫去，保留紫色，革蘭陰性菌染上的結(jié)晶紫容易被脫去，最后呈紅色。但當(dāng)酒精的濃度為70% 時(shí)，它的脫色能力最強(qiáng)，可能使革蘭陽性菌染上的結(jié)晶紫也被脫去，使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
綜上所述，影響染色的其他因素，還有菌體細(xì)胞的構(gòu)造和其外膜的通透性，如細(xì)胞膜的通透性、膜孔的大小和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整與否，在染色上都起一定作用。此外，培養(yǎng)基的組成、菌齡、染色液中的電介質(zhì)含量和pH、溫度、藥物的作用等，也都能影響細(xì)菌的染色，所以我們在染色時(shí)要注意當(dāng)染色結(jié)果與預(yù)想的結(jié)果出現(xiàn)不一致時(shí)，要考慮到這些因素的影響。對同學(xué)來講重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)操作因素的影響，使他們在一開始學(xué)習(xí)革蘭染色，就認(rèn)真對待，養(yǎng)成良好的學(xué)習(xí)態(tài)度，嚴(yán)格按照操作規(guī)程來做，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
