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發(fā)布日期:2023/9/26 9:18:00

  實(shí)驗(yàn)方法原理

  轉(zhuǎn)化活性是檢測(cè)質(zhì)粒生物活性的重要指標(biāo),在基因克隆技術(shù)中,轉(zhuǎn)化(transformation)是特指以質(zhì)粒 DNA 或以它為載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒 DNA(包括人工染色體)導(dǎo)入細(xì)胞的過(guò)程, 是一種常用的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 該過(guò)程的關(guān)鍵是受體細(xì)胞的遺傳學(xué)特性及其所處的生理狀態(tài),用于轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株,以防止對(duì)導(dǎo)入的外源的切割,用 R- M- 符號(hào)表示。 此外,為了便于檢測(cè),受體菌一般應(yīng)具有可選擇的標(biāo)記(例如抗生素敏感性、顏色變化等)。 但質(zhì)粒 DNA 能否進(jìn)入受體細(xì)胞則取決于該細(xì)胞是否處于感受態(tài)(competence)。所謂感受態(tài)是指受體細(xì)胞處于容易吸收外源 DNA 的一種生理狀態(tài),可通過(guò)物理化學(xué)的方法誘導(dǎo)形成,也可自然形成(自然感受態(tài))。 在基因工程技術(shù)中,通常是采用誘導(dǎo)的方法。 大腸桿菌是常用的受體菌,其感受態(tài)一般是通過(guò)用 CaCl2 在 0℃ 條件下處理細(xì)胞而形成,基本原理是: 細(xì)菌處于 0℃ 的 CaCl2 低滲溶液中,會(huì)膨脹成球形,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化,轉(zhuǎn)化混合物中的質(zhì)粒 DNA 形成抗 DNase 的羥基一鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面,經(jīng) 42 ℃ 短時(shí)間熱激處理,促進(jìn)細(xì)胞吸收 DNA 復(fù)合物,在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后,球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖,在選擇培養(yǎng)基上便可獲得所需的轉(zhuǎn)化子。

  實(shí)驗(yàn)材料 大腸桿菌PUC18 質(zhì)粒

  試劑、試劑盒 LB 液體培養(yǎng)基含(和不含)氨芐靑霉素的 LB 平板LB 培養(yǎng)基CaCl2

  儀器、耗材 塑料離心管微量進(jìn)樣器玻璃涂棒恒溫水浴鍋(37℃42℃)分光光度計(jì)臺(tái)式高速離心機(jī)

  實(shí)驗(yàn)步驟

  1. 制備感受態(tài)細(xì)胞

  1.1 將大腸桿菌 HB101 在 LB 瓊脂平板上劃線,37℃ 培養(yǎng) 16~20 h。

  1.2 在劃線平板上挑一個(gè)單菌落于盛有 20 ml LB 培養(yǎng)基的 250 ml 三角瓶中,37℃ 振蕩培養(yǎng)到細(xì)胞的 OD600 值為 0.3~0.5 之間,使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)前期。

  1.3 將培養(yǎng)物于冰溶中放置 10 min,然后轉(zhuǎn)移到 2 個(gè) 10 ml 預(yù)冷的無(wú)菌離心管中,4000 r/min,0℃~4℃ 亡離心 10 min。

  1.4 棄上清,倒置離心管 1 min, 流盡剩余液體后,置冰溶 10 min。

  1.5 分別向二管加入 5 ml 用冰預(yù)冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液懸浮細(xì)胞, 置冰浴中 20 min。 CaCl2 的純度至關(guān)重要,不同廠家,甚至同一廠家不同批號(hào)的產(chǎn)品,均影響感受態(tài)的形成。

  1.6 4000 r/min,0℃~4℃ 離心 10 min 回收菌體, 棄上清。分別向二管各加入 1 ml 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液,重新懸浮細(xì)胞,

  1.7 按每份 200 ul 分裝細(xì)胞于無(wú)菌小塑料離心管中,如果不馬上用可加入終濃度為 10% 的無(wú)菌甘油,置 -20℃ 或 -70℃ 存?zhèn)溆谩?br>
  制得的感受態(tài)細(xì)胞,如果在 4 ℃ 放置 12~24 h, 其轉(zhuǎn)化率可增高 4~6 倍,但 24 h 后,轉(zhuǎn)化率將下降。

  以上均嚴(yán)格無(wú)菌操作。

  2. 轉(zhuǎn)化

  2.1 加 10 ul 含約 0.5 ug 自制的 pUC18 質(zhì)粒 DNA 到上述制備的 200 ul 感受態(tài)細(xì)胞中。 同時(shí)設(shè)三組對(duì)照:不加質(zhì)粒;不加受體;加已知具有轉(zhuǎn)化活性的質(zhì)粒 DNA。具體操作參照下表進(jìn)行。

  2.2 將每組樣品輕輕混勻后,冰浴 30~40 min, 然后置 42℃ 水浴熱激 3 min, 迅速放回冰浴 1~2 min。

  2.3 向每組樣品中加入等體積的 2×LB 培養(yǎng)基,置 37℃ 保溫 1~1.5 h, 讓細(xì)菌中的質(zhì)粒表達(dá)抗生素抗性蛋白。

  2.4 每組各取 100 ul 混合物涂布于含氨芐青霉素(50 ug/ml)的選擇平板上,室溫下放置 20~30 min。

  2.5 待菌液被瓊脂吸收后,倒置平板于 37℃ 培養(yǎng) 12~16 h,觀察結(jié)果。

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