一、制片和染色的基本程序
微生物的染色方法很多,各種方法應(yīng)用的染料也不盡相同,但是一般染色都要通過制片及一套染色操作程序。
1、制片
在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水,用接種環(huán)進行無菌操作,挑取培養(yǎng)物少許,置載玻片的水滴中,與水混合做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層,為避免因菌數(shù)過多聚成集團,不利觀察個體形態(tài),可在載玻片之一側(cè)再加一滴水,從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進行稀釋,涂布成薄層,若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物中洗下制備的菌液,則直接涂布于載玻片上即可。
2、自然干燥
涂片在室溫下使其自然干燥,有時為了使之干得更快些,可將標本面向上,手持載玻片一端的兩側(cè),小心地在酒精燈上高處微微加熱,使水分蒸發(fā),但切勿緊靠火焰或加熱時間過長,以防標本烤枯而變形。
3、固定
標本干燥后即進行固定,固定的目的有三個:
1)殺死微生物,固定細胞結(jié)構(gòu)。
2)保證菌體能更牢的粘附在載玻片上,防止標本被水沖洗掉。
3)改變?nèi)玖蠈毎耐ㄍ感?,因為死的原生質(zhì)比活的原生質(zhì)易于染色。
固定常常利用高溫,手執(zhí)載玻片的一端(涂有標本的遠端),標本向上,在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3—4次,共約2—3秒鐘,并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚,不覺過燙為宜(不超過60℃),放置待冷后,進行染色。
以上這種固定法在微生物實驗室中雖然應(yīng)用較多普遍,但是應(yīng)當指出,在研究微生物細胞結(jié)構(gòu)時不適用,應(yīng)采用化學(xué)固定法。化學(xué)固定法zui常用的固定劑有:酒精(95%),酒精和醚各半的混合物,丙酮,1—2%的餓酸等。餓酸能很快固定細胞但不改變其結(jié)構(gòu),故較常用。應(yīng)用餓酸固定細胞的技術(shù)如下:在培養(yǎng)皿中放一玻璃,在玻璃上放置玻璃毛細管,在毛細管中注入少量的1—2%餓酸溶液,同時在玻璃上再放置濕標本涂片的載玻片,然后把培養(yǎng)皿蓋上,經(jīng)過1—2分鐘后把標本從培養(yǎng)皿中取出,并使之干燥。
4、染色
標本固定后,滴加染色液。染色的時間各不相同,視標本與染料的性質(zhì)而定,有時染色時還要加熱。染料作用標本的時間平均約1—3分鐘,而所有的染色時間內(nèi),整個涂片(或有標本的部分)應(yīng)該浸在染料之中。
若作復(fù)合染色,在媒染處理時,媒染劑與染料形成不溶性化合物,可增加染料和細菌的親和力。一般固定后媒染,但也可以結(jié)合固定或染色同時進行。
5、脫色
用醇類或酸類處理染色的細胞,使之脫色??蓹z查染料與細胞結(jié)合的穩(wěn)定程度,鑒別不同種類的細菌。常用的脫色劑是95%酒精和3%鹽酸溶液。
6、復(fù)染
脫色后再用一種染色劑進行染色,與不被脫色部位形成鮮明的對照,便于觀察。革氏染色在酒精脫色后用番紅,石碳酸復(fù)紅zui后進行染色,就是復(fù)染。
7、水洗
染色到一定的時候,用細小的水流從標本的背面把多余的染料沖洗掉,被菌體吸附的染料則保留。
8、干燥
著色標本洗凈后,將標本晾干,或用吸水紙把多余的水吸去,然后晾干或微熱烘干,用吸水紙時,切勿使載玻片翻轉(zhuǎn),以免將菌體擦掉。
9、鏡檢
干燥后的標本可用顯微鏡觀察。
綜上所述,染色的基本程序如下:
制片→固定→媒染→染色→脫色→復(fù)染→水洗→干燥→鏡檢。
二、染色方法
微生物染色方法一般分為單染色法和復(fù)染色法兩種。前者用一種染料使微生物染色,但不能鑒別微生物。復(fù)染色法是用兩種或兩種以上染料,有協(xié)助鑒別微生物的作用。故亦稱鑒別染色法。常用的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法,此外還有鑒別細胞各部分結(jié)構(gòu)的(如芽胞、鞭毛、細胞核等)特殊染色法。食品微生物檢驗中常用的是單染色法和革蘭氏染色法。
1、單染色法
用一種染色劑對涂片進行染色,簡便易行,適于進行微生物的形態(tài)觀察。在一般情況下,細菌菌體多帶負電荷,易于和帶正電荷的堿性染料結(jié)合而被染色。因此,常用堿性染料進行單染色,如美蘭、孔雀綠、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫和中性紅等。若使用酸性染料,多用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅等。使用酸性染料時,必須降低染液的PH值,使其呈現(xiàn)強酸性(低于細菌菌體等電點),讓菌體帶正電荷,才易于被酸性染料染色。
單染色一般要經(jīng)過涂片、固定、染色、水洗和干燥五個步驟。
染色結(jié)果依染料不同而不同:
石碳酸復(fù)紅染色液:著色快,時間短,菌體呈紅色。
美蘭染色液:著色慢,時間長,效果清晰,菌體呈蘭色。
草酸銨結(jié)晶染色液:染色迅速,著色深,菌體呈紫色。
2、革蘭氏染色法
革蘭氏染色法是細菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法,1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。
細菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色,而經(jīng)碘液媒染后,用酒精脫色,在一定條件下有的細菌此色不被脫去,有的可被脫去,因此可把細菌分為兩大類,前者叫做革蘭氏陽性菌(G+),后者為革蘭氏陰性菌(G—)。為觀察方便,脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進行復(fù)染。陽性菌仍帶紫色,陰性菌則被染上紅色。有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)和球菌,以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應(yīng);弧菌,螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)負反應(yīng)。
革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有很多差別,染色反應(yīng)不一樣?,F(xiàn)在一般認為革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物,它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢,不易脫色,陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度底,吸附染料差,易脫色,這是染色反應(yīng)的主要依據(jù)。
另外,陽性菌菌體等電點較陰性菌為低,在相同PH條件下進行染色,陽性菌吸附堿性染料很多,因此不易脫去,陰性菌則相反。所以染色時的條件要嚴格控制。例如,在強堿的條件下進行染色,兩類菌吸附堿性染料都多,都可呈正反應(yīng);PH很低時,則可都呈負反應(yīng)。此外,兩類菌的細胞壁等對結(jié)晶紫—碘復(fù)合物的通透性也不一致,陽性菌透性小,故不易被脫色,陰性菌透性大,易脫色。所以脫色時間,脫色方法也應(yīng)嚴格控制。
革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個步驟,具體操作方法是:
1)涂片固定。
2)草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘。
3)自來水沖洗。
4)加碘液覆蓋涂面染1分鐘。
5)水洗,用吸水紙吸去水分。
6)加95%酒精數(shù)滴,并輕輕搖動進行脫色,30秒后水洗,吸去水分。
7)蕃紅梁色液(?。┤?0秒鐘后,自來水沖洗。干燥,鏡檢。
染色的結(jié)果,革蘭氏正反應(yīng)菌體都呈紫色,負反應(yīng)菌體都呈紅色。