大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取
質(zhì)粒DNA的提取是從事基因工程工作中的一項(xiàng)基本實(shí)驗(yàn)技術(shù),但提取方法有很多種,以下介紹一種最常用的方法:堿裂解法:此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取,提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴(kuò)增、銀染序列分析。
方法如下:
1、接1%含質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞于2ml LB培養(yǎng)基。
2、37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
3、取1.5ml菌體于Ep管,以4000rpm離心3min,棄上清液。
4、加0.lml溶液I(1%葡萄糖,50mM/L EDTA pH8.0,25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH,1% SDS),輕輕翻轉(zhuǎn)混勻,置于冰浴5 min .
6、加入0.15m1預(yù)冷溶液III(5 mol/L KAc,pH4.8),輕輕翻轉(zhuǎn)混勻,置于冰浴5 min .
7、以10,000rpm離心20min,取上清液于另一新Ep管
8、加入等體積的異戊醇,混勻后于0℃靜置10min.
9、再以10,000rpm離心20min,棄上清。
10、用70%乙醇0.5ml洗滌一次,抽干所有液體。
11、待沉淀干燥后,溶于0.05mlTE緩沖液中
煮沸法
1、將1.5ml培養(yǎng)液倒入eppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。
2、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘,使液體流盡。
3、將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中, 渦旋混勻。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 渦旋振蕩3秒鐘。
5、將eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量離心機(jī)4℃下12000g離心10分鐘。
7、用無(wú)菌牙簽從eppendorf管中去除細(xì)菌碎片。
8、取20ml進(jìn)行電泳檢查。
注意
1. 對(duì)大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落直接進(jìn)行煮沸法提取質(zhì)粒DNA.
2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,濃度高時(shí),細(xì)菌裂解效果反而不好。有時(shí)不同溶菌酶也能溶菌。
3. 提取的質(zhì)粒DNA中會(huì)含有RNA,但RNA并不干擾進(jìn)一步實(shí)驗(yàn),如限制性內(nèi)切酶消化,亞克隆及連接反應(yīng)等