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發(fā)布日期:2023/10/26 10:18:00

質(zhì)粒提取主要有堿裂解法,煮沸裂解法,小量一步提取法等。

1、堿裂解法原理:根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓?fù)鋵W(xué)
結(jié)構(gòu)差異來(lái)分離的。在強(qiáng)堿環(huán)境下,細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被破壞,基因組DNA和質(zhì)粒DNA被釋放出來(lái),線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞而發(fā)生變性。雖然在強(qiáng)堿的條件下共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會(huì)發(fā)生變性,但兩條互補(bǔ)鏈仍會(huì)互相盤繞,并緊密的結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的乙醋酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復(fù)中性時(shí),共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性快,而線性的染色體DNA復(fù)性緩慢,細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會(huì)相互纏繞成大型復(fù)合物,后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當(dāng)用鉀離子取代鈉離子時(shí),復(fù)合物會(huì)從溶液中有效地沉淀下來(lái),離心除去變性劑后,就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA。

2、煮沸法裂解:將細(xì)菌懸浮于含Triton X-100
和能消化細(xì)胞壁的溶菌酶緩沖液中,然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細(xì)胞壁外,還有助于解開(kāi)DNA鏈的堿基配對(duì),并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。但是,閉環(huán)質(zhì)粒DNA彼此不會(huì)分離,這是因?yàn)樗麄兊牧姿岫ス羌芫哂谢ハ嗬p繞的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),當(dāng)溫度下降后,閉環(huán)DNA的堿基又各自就位,形成超螺旋分子,離心除去變性的染色體核蛋白質(zhì),就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。

煮沸裂解法
對(duì)于小于15kb的小質(zhì)粒很有效,可用于提取步至lmL(小量制備),多至250mL(大量制備)菌液的質(zhì)粒,并且對(duì)大多數(shù)的大腸桿菌菌株都適用。

3、小量一步提取法:由于細(xì)菌染色體DNA
比質(zhì)粒大得多,受機(jī)械力后細(xì)菌染色體DNA會(huì)被震斷成不同大小的線性片段而纏繞附著在細(xì)胞碎片上,并發(fā)生變性。同樣受機(jī)械力質(zhì)粒DNA會(huì)變性,機(jī)械力消失后復(fù)性。但質(zhì)粒DNA的復(fù)性快,仍溶于溶液而細(xì)菌染色體DNA復(fù)性較慢,會(huì)形成不溶的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),通過(guò)高速離心可以分離得到質(zhì)粒DNA 。
 

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