核蛋白的簡(jiǎn)介
核蛋白(nucleoprotein)因其最初發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞核中,故稱(chēng)為核蛋白,它是細(xì)胞中的一種結(jié)合蛋白質(zhì)。在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中都含有核蛋白。此外,在病毒、染色體和核蛋白體中也含有核蛋白。核蛋自在生物的生長(zhǎng)和繁殖過(guò)程中有著獨(dú)特的功能和作用。
核蛋白是由帶陽(yáng)離子性質(zhì)的堿性蛋白質(zhì)(如組蛋白和魚(yú)精蛋白)和蛋白質(zhì)輔基(核酸)所構(gòu)成。組蛋白含有堿性氨基酸(如賴(lài)氨酸和精氨酸),所以具有堿性。其相對(duì)分子質(zhì)量為11 000~21 000。魚(yú)精蛋白存在于某些魚(yú)精核蛋白中,由于富含精氨酸,因此也具有堿性。
核蛋白的提取方法
柱式法 Minute TM 胞質(zhì)胞核分離試劑盒操作方法:
A. 懸浮細(xì)胞樣品(包括植物,細(xì)菌,酵母和真菌制備的原生質(zhì)體)
1.500Xg,3 分鐘低速離心收集細(xì)胞,用預(yù)冷的 PBS 清洗一次
2. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 1.5 ml 離心管中,3000 rpm 離心 1-5 分鐘,棄去上清。
3. 加入適量的胞漿提取緩沖液(請(qǐng)注意樣品及裂解液的比例,以達(dá)到最佳效果), 渦旋大力震蕩 15 秒, 冰上孵育 5 分鐘, 混勻. 接轉(zhuǎn)胞質(zhì)胞核分離步驟。
B. 貼壁細(xì)胞
1. 貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度 90-100%,將預(yù)冷的 PBS 直接加入細(xì)胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中清洗細(xì)胞兩次,吸去上清。
2. 將適量的胞漿提取緩沖液均勻的加入整個(gè)器皿表面,冰上靜置 5 分鐘。用吸頭吹打幾次后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 1.5 ml 離心管中。渦旋大力震蕩 15 秒。接轉(zhuǎn)胞質(zhì)胞核分離步驟。(請(qǐng)注意樣品及裂解液的比例,如濃度較低請(qǐng)減少裂解液使用量)
C.組織樣品
1. 稱(chēng)重適量組織樣品,放入預(yù)冷的 1.5 ml 離心管中。
2. 用預(yù)冷的 PBS 清洗組織樣品一次。3000rpm 離心 1 分鐘,棄去上清,盡可能的使沉淀干燥。
3. 加入適量胞漿提取緩沖液,用微型管杵或微粉碎機(jī)勻漿,去除沒(méi)有完全勻漿的組織碎片。接轉(zhuǎn)胞質(zhì)胞核分離步驟。
胞質(zhì)胞核分離步驟
1. 4oC,最高速 (14000-16000 rpm) 離心 5 分鐘
2. 將上清液(上清為胞漿組份)轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的預(yù)冷的 1.5 ml 離心管中。將沉淀(可選優(yōu)化:用 0.5 ml 預(yù)冷 PBS 重懸,10000 rpm,離心 3-5 分鐘清洗沉淀可以減少胞漿蛋白污染)中加入適量的胞核提取緩沖液,渦旋大力震蕩 15 秒,冰上孵育 1 分鐘。
然后重復(fù)震蕩 15 秒,冰上孵育 1 分鐘四次。(如核蛋白提取濃度低,可適當(dāng)延長(zhǎng)每次孵育及震蕩時(shí)間)
3. 迅速將核提取物轉(zhuǎn)入到預(yù)冷的離心管套管中,14000-16000 rpm,離心 30 秒。棄掉離心管柱。將核蛋白儲(chǔ)存于-80℃。一般產(chǎn)量 1.5-2.5 mg/ml。