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發(fā)布日期:2023/10/12 11:04:00

微生物染色的基本原理,是借助物理因素和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。物理因素如細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等。化學(xué)因素則是根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生地各種化學(xué)反應(yīng)。酸性物質(zhì)對于堿性染料較易吸附,且吸附作用穩(wěn)固;同樣,堿性物質(zhì)對酸性染料較易于吸附。如酸性物質(zhì)細(xì)胞核對于堿性染料就有化學(xué)親和力,易于吸附。但是,要使酸性物質(zhì)染上酸性材料,必須把它們的物理形式加以改變(如改變pH值),才利于吸附作用的發(fā)生。相反,堿性物質(zhì)(如細(xì)胞質(zhì))通常僅能染上酸性染料,若把它們變?yōu)檫m宜的物理形式,也同樣能與堿性染料發(fā)生吸附作用。

 



常用染色法

單染色法

只用一種染料染色。由于大多數(shù)細(xì)菌胞漿內(nèi)含有酸性物質(zhì),可與堿性染料結(jié)合,故常用呂氏美藍(lán)、結(jié)晶紫和稀釋石碳酸復(fù)紅等染液。此法可觀察細(xì)菌的大小、形態(tài)與排列,不能顯示細(xì)菌的結(jié)構(gòu)與染色特性。

2.復(fù)染色法

用兩種或兩種以上不同染料可將細(xì)菌染成不同的顏色,除可觀察細(xì)菌的大小、形態(tài)與排列外,還反應(yīng)出細(xì)菌染色特性,具有鑒別細(xì)菌種類的價值。常用的有革蘭染色法和抗酸染色法。

(1)革蘭染色:①細(xì)菌涂片經(jīng)火焰固定,加結(jié)晶紫染液染1min,清水沖去染液。②加碘液媒染 1min,水洗,甩干。③用95%乙醇脫色,輕輕搖動約30s,至無紫色洗落為止,水洗,甩干。④加稀釋石碳酸復(fù)紅或沙黃染液數(shù)滴進(jìn)行復(fù)染,約30s,水洗。⑤干后顯微鏡下鏡檢觀察結(jié)果,革蘭陽性菌染成紫色,革蘭陰性菌為紅色。

(2)抗酸染色:萋-尼 (Ziehl-Neelse)抗酸染色法:

①細(xì)菌涂片經(jīng)火焰固定,加石炭酸復(fù)紅溶液,徐徐加熱至有蒸氣出現(xiàn),切不可沸騰。染液因蒸發(fā)減少時,應(yīng)隨時補(bǔ)充,防止染液蒸干。持續(xù)染5min(奴卡菌需要加長時間),水洗,甩干。

②滴加3%鹽酸乙醇脫色,不時搖動玻片至無紅色脫落為止,水洗,甩干。

③加呂氏美藍(lán)復(fù)染液數(shù)滴復(fù)染1min,水洗。

④干后顯微鏡下鏡檢觀察結(jié)果,抗酸桿菌染成紅色,非抗酸桿菌為藍(lán)色。

金胺O-羅丹明B染色法:①細(xì)菌涂片固定后加第1液30——90s。②棄去第1液后加第2液染15min。③用第3液脫色1——2min,水洗。④滴加第4液染30s,水洗,

⑤干后置熒光顯微鏡下鏡檢觀察結(jié)果 在淡藍(lán)色背景下,抗酸桿菌呈紅色,其它細(xì)菌和細(xì)胞呈藍(lán)色。

3.特殊染色法

(1)鞭毛染色(改良Ryu法):

①玻片的處理 將新載玻片浸泡在95%乙醇中。臨用時取出,以干凈紗布擦干。

②在玻片上滴蒸餾水1滴。

③挑取培養(yǎng)物少許,輕觸蒸餾水滴頂部,僅允許極少量細(xì)菌進(jìn)入水滴,不可攪動,以免鞭毛脫落。④置35℃孵箱自然干燥,不能用火焰固定,滴加鞭毛染液染1——2 min輕輕水洗。

⑤干后顯微鏡鏡檢觀察結(jié)果 鞭毛和菌體呈紫色。

(2)異染顆粒染色(阿爾培托法):

①細(xì)菌涂片經(jīng)火焰固定,加甲液染色3——5min。水洗。

②滴加乙液,染1min。水洗。

③干后顯微鏡鏡檢觀察結(jié)果 菌體呈綠色,異染顆粒呈藍(lán)黑色,用于白喉棒狀桿菌染色。

(3)莢膜染色:

①奧爾特莢膜染色法:將已固定的細(xì)菌涂片滴加3%沙黃染液,用火焰加溫染色,持續(xù)3min,冷卻后水洗,待干鏡檢。結(jié)果:菌體呈褐色,莢膜呈黃色,此法主要用于碳疽芽胞桿菌。

②Hiss氏硫酸銅法:染液:第一液為結(jié)晶紫乙醇飽和液5ml加蒸餾水95ml 的混合液;第二液為20%硫酸銅水溶液。方法:細(xì)菌涂片自然干燥,乙醇固定。滴加第一液,微加熱染1min。再用第二液將涂片上的染液洗去,勿再水洗,傾去硫酸銅液,以吸水紙吸干鏡檢。結(jié)果:菌體及背景呈紫色,莢膜呈鮮藍(lán)色或不著色。

(4)芽胞染色:

染液:第一液為萋-納氏石炭酸復(fù)紅液,第二液為95%乙醇,第三液為堿性美藍(lán)液。

方法:將已固定的細(xì)菌涂片滴加第一液,微加熱染5min,冷卻后水洗。用第二液脫色2min,水洗。加第三液復(fù)染1min,水洗,待干鏡檢。結(jié)果:菌體呈藍(lán)色,芽胞呈紅色。

4.負(fù)染色法

背景著色而菌體本身不著色的染色為負(fù)染色法。最常見的是墨汁負(fù)染色法,用來觀察真菌及細(xì)菌莢膜等。在標(biāo)本涂片處滴加染液,混合后加上蓋玻片(勿產(chǎn)生氣泡),輕壓。在低倍鏡下尋找有莢膜的菌細(xì)胞,轉(zhuǎn)高倍鏡或油鏡確認(rèn),如新型隱球菌可見寬厚透亮的莢膜,背景為黑色。

5.熒光染色法

經(jīng)熒光素染色的細(xì)菌,或熒光素標(biāo)記的熒光抗體與相應(yīng)抗原的細(xì)菌、病毒結(jié)合形成的復(fù)合物,在熒光顯微鏡下發(fā)出熒光。

細(xì)菌染色的一般程序

細(xì)菌染色的一般程序是:涂片(干燥)—固定—染色(媒染)—(脫色)—(復(fù)染)。

涂片制備

血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液體培養(yǎng)物,直接在載玻片上作薄膜涂片;尸檢或感染動物組織,病變局部涂抹采樣的棉拭子直接涂片。固體培養(yǎng)基上的菌落或菌苔的制片,先用接種環(huán)取一環(huán)生理鹽水置載玻片中央,再用無菌接種環(huán)取少量的培養(yǎng)物在生理鹽水中磨勻,涂布成1cm2大小的涂面,置室溫下自然干燥或遠(yuǎn)火慢慢烘干。

2.固定

目的是殺死細(xì)菌,凝固細(xì)菌蛋白及結(jié)構(gòu),便于染色;促使細(xì)菌粘附在載玻片上,避免在水洗過程中被水沖掉;改變細(xì)菌對染料的通透性,有利于菌細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的染色。通常用火焰加熱固定,將已干燥的涂片在火焰中迅速通過3次,以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。

3.染色

根據(jù)檢驗?zāi)康牟煌?,選擇不同的染色方法進(jìn)行染色。染色時滴加染液,以復(fù)蓋標(biāo)本為度。

4.媒染

凡能增強(qiáng)染料和被染物的親和力,使染料固定于被染物及能引起細(xì)胞膜通透性改變的物質(zhì),稱媒染劑。常用的有明礬、鞣酸、金屬鹽和碘等,也有用加熱法促進(jìn)著色。媒染劑可用于初染與復(fù)染之間,也可用于固定之后或含于固定液、染色中。

5.脫色

凡能使已著色的被染物脫去顏色的化學(xué)試劑稱為脫色劑。常用乙醇、丙酮等作為脫色劑。脫色劑可以查出細(xì)菌與染料結(jié)合的穩(wěn)定程度,作為鑒別染色之用。

6.復(fù)染

已脫色處理的細(xì)菌或其結(jié)構(gòu)常以復(fù)染液作復(fù)染以便于觀察。復(fù)染液與初染液的顏色不同而成一鮮明對比。復(fù)染不宜太強(qiáng),以免掩蓋初染的顏色。

主要用于厭養(yǎng)菌動力的檢查。通常選用60——70mm長。0.5——1.0mm孔徑的毛細(xì)管虹吸厭養(yǎng)菌懸液后,用火焰將毛細(xì)管兩端熔封。并用塑膠紙將毛細(xì)管固定在載玻片上,置高倍鏡下暗視野觀察。
 

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